Introduction:
La Cryomicroscopie Electronique en Transmission (Cryo-MET) de macromolécules biologiques, et les techniques de reconstruction tridimensionnelle (3D) sont employées dans nos recherches pour étudier l'architecture d'assemblages macromoléculaires de trois types: (i) complexes multi-enzymatiques, (ii) virus et protéines de capside, et (iii) nanoparticules composites. Plusieurs progrès technologiques ont mené récemment à une croissance explosive dans ce domaine et ont permis d'étudier les structures et les interactions moléculaires à des résolutions en dessous du nanomètre. Par conséquent, l'approche de Cryo-MET 3D combinée avec d'autres techniques de biologie structurale (diffusion de la lumière, SAXS, SANS, cristallographie des rayons X, Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN), Analyse des Modes Normaux (AMN) et modélisation moléculaire etc..) sont maintenant employées pour résoudre la structure de protéine, et pour fournir une vision dynamique multi-échelles des assemblages macromoléculaires en action.
L'apport le plus important de la Cryo-MET 3D, est qu'elle fournit une structure à haute résolution globale des assemblages macromoléculaires, préservés dans leurs conditions physiologiques d'activité. Pour cela, les échantillons sont instantanément congelés dans leurs conditions environnementales habituelles (hydratation, pH, sels, détergents, cofacteurs, analogues de l'ATP, ARN, ADN, etc.....) par plongement rapide des grilles d'échantillons dans l'éthane liquide. Dans de telles conditions, la formation de cristaux de glace qui endommageraient l'intégrité des assemblages est évitée, et les échantillons sont préservées en les fixant dans une glace vitreuse. Les grilles de spécimen sont alors maintenues à la température d'azote liquide, au cours de leur insertion et observation dans le microscope électronique, sans emploi d'agent colorant ou de fixation chimique. Nous avons maintenant accès à deux JEOL de haute résolution 2100 et 2100F , équipés de caméras CCD de 4K et de 2K Gatan Ultrascan, utilisées pour la collection automatisée d'images, et nous employons également les films photographiques Kodak So163 pour les données de résolutions les plus élevées. Selon l'hétérogénéité structurale des échantillons, des groupes de 10.000 à 200.000 images individuelles de particules peuvent être employées pour obtenir une carte 3D à des résolutions en dessous du nanomètre.
Des techniques d'analyse d'images et de calculs intensifs sur réseaux d'ordinateurs sont développées sans cesse pour extraire et traiter le signal provenant des images bruitées de Cryo-MET. Par exemple, (i) des variations de contraste résultant de la fonction de transfert de contraste (FTC) des microscopes électroniques doivent être exactement estimées et corrigées ; (ii) les directions de projection de grandes séries d'images bruitées doivent être déterminées avec précision par des alignements itératifs ; (iii) et une fois qu'une carte de Cryo-MET 3D est obtenue, cette information doit être combinée avec d'autres approches (rayon X, RMN, AMN, etc..) afin de relier l'aspect dynamique de ces structure à leurs activités biologiques. Finalement, ces données doivent être déposées dans la banque de données structurale "Macromolecular Structure Database" (MSD) pour bénéficier à toutes les communautés de chercheurs.
Nos efforts de recherches se concentrent actuellement sur :
- Deux complexes multi-enzymatiques (la Glutamate synthase bactérienne, responsable du métabolisme de l'amoniaque dans ces organismes, et la Phosphorylase Kinase de mammifères, une enzyme clé de la glycogénolyse et la cible potentielle d'une nouvelle génération de médicaments anti-diabétiques.
- Plusieurs virus nouvellement découverts hyperthermophiles et hallophiles infectant les archaebactéries.
- Le mécanisme calcium et pH-dépendant de gonflement de certains virus de plantes.
- L'observation de points quantiques et de nouvelles nanoparticules composites par Cryo-MET.
- Le développement d'algorithmes d'analyse d'images pour la reconstruction 3D à haute résolution (e.g., estimation et correction de la fonction de transfert de contraste (FTC), ou calcul des structures 3D de particules hétérogènes, etc..).
 |
Jonic S, Sorzano COS, Cottevieille M, Larquet E, Boisset N. A novel method for improvement of visualization of power spectra for sorting cryo-electron micrographs and their local areas, J Struct Biol , vol. 157, pp. 156–167 , 2007. |
Nous développons également plusieurs projets technologiques sur:
- La congélation automatique rapide des échantillons sous environnement contrôlé.
- La numérisation rapide à haut débit de négatifs et l'automatisation des prises de vues.
|
